L'associazione topologica dei confini dei domini è necessaria per la normale funzione del genoma

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 435 (2023) Citare questo articolo

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I confini del dominio di associazione topologica (TAD) suddividono il genoma in territori regolatori distinti. Prove aneddotiche suggeriscono che la loro interruzione può interferire con la normale espressione genetica e causare fenotipi patologici1,2,3, ma la portata complessiva di ciò rimane sconosciuta. Qui dimostriamo che le eliminazioni mirate dei confini del TAD causano una serie di interruzioni della normale funzione genomica in vivo e dello sviluppo dell'organismo. Abbiamo utilizzato l'editing del genoma CRISPR nei topi per eliminare individualmente otto confini TAD (11-80 kb di dimensione) dal genoma. Tutte le delezioni esaminate hanno prodotto fenotipi molecolari o organismici rilevabili, che includevano interazioni cromatiniche o espressione genica alterate, vitalità ridotta e fenotipi anatomici. Abbiamo osservato cambiamenti nell'architettura locale della cromatina 3D in 7 casi su 8 (88%), inclusa la fusione di TAD e frequenze di contatto alterate all'interno dei TAD adiacenti al confine eliminato. Per 5 loci su 8 (63%) esaminati, le delezioni dei confini erano associate ad un aumento della letalità embrionale o ad altri fenotipi dello sviluppo. Ad esempio, una delezione del confine TAD vicino a Smad3/Smad6 ha causato la completa letalità embrionale, mentre una delezione vicino a Tbx5/Lhx5 ha provocato una grave malformazione polmonare. I nostri risultati dimostrano l'importanza delle sequenze di confine TAD per la funzione del genoma in vivo e rafforzano la necessità fondamentale di considerare attentamente la potenziale patogenicità delle delezioni non codificanti che influenzano i confini del TAD nello screening genetico clinico.

I genomi eucariotici si ripiegano in domini topologicamente associati (TAD), segmenti di cromatina su scala sub-megabase caratterizzati da un'elevata frequenza di contatto della cromatina intra-dominio4,5,6. I TAD rappresentano una caratteristica chiave dell'organizzazione gerarchica del genoma definendo i quartieri cromatinici all'interno dei quali le sequenze regolatrici possono interagire, isolando contemporaneamente le interazioni regolatorie oltre i confini5,7,8,9,10. I confini del TAD sono definiti e misurati principalmente attraverso test di conformazione della cromatina e sono tipicamente associati a un insieme caratteristico di proteine, tra cui il fattore legante CCCTC (CTCF), componenti del complesso di mantenimento strutturale dei cromosomi (SMC) come coesione e condensina, e RNA polimerasi II5,11,12,13,14. I TAD si formano come risultato dell'estrusione dell'anello, in cui i filamenti di DNA scivolano dall'interno del complesso di coesione o SMC finché non vengono incontrate le molecole CTCF legate in un orientamento convergente13,15,16,17,18,19. La perdita di CTCF, coesione o del fattore di carico della coesione Nipbl determina l'interruzione del TAD, mentre la perdita del fattore di rilascio della coesione, Wapl, determina il rafforzamento dei confini del TAD20,21. Curiosamente, circa il 20% dei confini del TAD rimane stabile dopo la perdita di CTCF22. Sia i meccanismi mediati da CTCF che la trascrizione possono influenzare la formazione e la funzione dei TAD, ma nessuno dei due sembra essere individualmente sufficiente né universalmente richiesto7,11,23,24. Pertanto, lo stato della cromatina, l'attività trascrizionale e l'organizzazione del TAD possono influenzarsi a vicenda e la struttura nucleare osservata dei genomi dei mammiferi probabilmente deriva dalla loro complessa interazione7,11,23,24,25.

Le posizioni genomiche dei confini del TAD sono ben conservate nelle specie di mammiferi, indicando che la loro funzione e posizione all'interno del genoma sono soggette a vincoli evolutivi5,26,27,28. Questa nozione è ulteriormente supportata dall’esaurimento complessivo delle varianti strutturali ai confini del TAD osservato nella popolazione umana generale26, mentre le interruzioni e i riarrangiamenti della struttura del TAD sono stati implicati nell’errata espressione dei geni e sono associati a fenotipi dello sviluppo e del cancro1,2, 3,29,30. Tuttavia, la maggior parte di queste interruzioni erano dovute a grandi mutazioni strutturali spontanee che includevano anche caratteristiche genomiche vicine, come elementi regolatori e/o geni codificanti proteine. Pertanto, il ruolo specifico dei confini TAD in questi fenotipi non è ben compreso. Nel presente studio, esaminiamo la necessità funzionale delle sequenze di confine TAD in vivo. Abbiamo selezionato otto confini TAD indipendenti in prossimità di geni attivi durante lo sviluppo embrionale, abbiamo eliminato individualmente questi confini dal genoma del topo ed esaminato sistematicamente le conseguenze sulla sopravvivenza, sull'organizzazione del genoma, sull'espressione genica e sullo sviluppo. Tutte e otto le eliminazioni dei confini del TAD hanno causato alterazioni di una o più di queste proprietà. Abbiamo anche osservato che la perdita di confini con più siti CTCF generalmente risultava in fenotipi più gravi e che i fenotipi organismici più gravi coincidevano con cambiamenti pronunciati nella conformazione della cromatina. In combinazione, i nostri risultati indicano che le sequenze di confine TAD sono necessarie per la normale funzione e sviluppo del genoma.

3300 previously annotated TAD boundaries5,10, we scored and prioritized each boundary based on the following criteria: (1) CTCF occupancy aggregated from 62 published CTCF ChIP-seq datasets, which served as a proxy for the expected overall strength of insulation (datasets listed in Supplementary Data 1); (2) co-occupancy of subunits of the cohesin complex and the transcription factor Znf14331 from 38 published ChIP-seq datasets (Supplementary Data 1); (3) CTCF-binding conservation at orthologous regions in four different mammalian species32 (Supplementary Data 2); and (4) whether both flanking TADs contain genes with known roles in embryonic development, preferentially showing divergent patterns of tissue-specific expression (Fig. 1, Supplementary Fig. 1, Supplementary Data 1–3, “Methods”). TAD boundaries that encompassed protein-coding genes were excluded. Following genome-wide prioritization, we selected and deleted 8 individual TAD boundaries from the mouse genome through pronuclear injection of fertilized eggs using CRISPR/Cas9. For all deletions, the outer borders of the boundaries were defined by canonical criteria including the presence of CTCFs and cohesin complex proteins, which are the hallmark of TAD boundaries that are conserved across cell types in closely related species (refs. 13,15,16,17,18,19; see “Methods” for details). These deletions ranged in size from 11 to 80 kb and removed all known CTCF and cohesin binding sites in each TAD boundary region, while leaving any nearby protein-coding genes intact (Fig. 1, Supplementary Fig. 1, Supplementary Data 3, “Methods”). For all eight boundaries, live founder mice heterozygous for the targeted deletion were successfully obtained and bred into stable lines to assess molecular and organismal phenotypes./p>

6000 data points across 350 total measurements; Fig. 4a, Supplementary Fig. 10 and Supplementary Data 7). These systematic phenotyping efforts identified 30 additional parameters with individually significant deviations from wild-type controls (Supplementary Data 7). However, due to the limited sample size and the large number of parameters assessed, these initial observations are generally not significant after correction for multiple hypothesis testing. Nevertheless, in conjunction with the independently observed viability, chromatin, and expression phenotypes in these lines, these data provide leads for further in-depth characterization./p>

0.05; Fig. 3 and Supplementary Fig. 4. Interaction frequencies between genomic loci were additionally visualized on Juicebox (Supplementary Fig. 4)53,54./p>