Totale | Gruppo isolante Jiaxing

Natura volume 615, pagine 925–933 (2023) Citare questo articolo

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Il raddoppiamento dell'intero genoma (WGD) è un evento ricorrente nei tumori umani e promuove l'instabilità cromosomica e l'acquisizione di aneuploidie1,2,3,4,5,6,7,8. Tuttavia, l'organizzazione tridimensionale della cromatina nelle cellule WGD e il suo contributo ai fenotipi oncogenici sono attualmente sconosciuti. Qui mostriamo che nelle cellule carenti di p53, il WGD induce la perdita di segregazione della cromatina (LCS). Questo evento è caratterizzato da una ridotta segregazione tra cromosomi corti e lunghi, sottocompartimenti A e B e domini cromatinici adiacenti. LCS è guidato dalla downregulation di CTCF e H3K9me3 nelle cellule che hanno bypassato l'attivazione del checkpoint tetraploide. Le analisi longitudinali hanno rivelato che LCS prepara le regioni genomiche per il riposizionamento dei sottocompartimenti nelle cellule WGD. Ciò si traduce in cambiamenti cromatinici ed epigenetici associati all'attivazione dell'oncogene nei tumori derivanti dalle cellule WGD. In particolare, gli eventi di riposizionamento dei sottocompartimenti erano in gran parte indipendenti dalle alterazioni cromosomiche, il che indica che questi erano meccanismi complementari che contribuivano allo sviluppo e alla progressione del tumore. Nel complesso, LCS avvia cambiamenti nella conformazione della cromatina che alla fine si traducono in modifiche epigenetiche e trascrizionali oncogeniche, il che suggerisce che l'evoluzione della cromatina è un segno distintivo del cancro guidato dal WGD.

Il WGD è definito dalla duplicazione dell'intero set di cromosomi all'interno di una cellula. È stata osservata in lesioni precoci e precancerose di vari tessuti2,9,10 e si stima che sia presente in circa il 30% dei tumori umani3. Il WGD favorisce l'acquisizione di alterazioni cromosomiche5,6,7,8 in contesti genetici permissivi, come nelle cellule carenti di p53 o Rb3,4, che possono promuovere la tumorigenesi1,5. Tuttavia, è altrettanto probabile che la tetraploidizzazione in singoli nuclei induca alterazioni nella struttura tridimensionale (3D) e nelle caratteristiche epigenetiche della cromatina. Durante l'interfase, la cromatina è organizzata in un'architettura 3D multistrato di compartimenti, domini cromatinici e anelli11,12,13,14,15,16 ed è strettamente associata all'attività della cromatina e agli stati cellulari17. Alterazioni della struttura della cromatina sono state segnalate in molti tipi di tumore e sono dovute a CTCF alterato o legame di coesione18,19, varianti strutturali cromosomiche20,21,22 o modifiche aberranti degli istoni22,23,24,25. Qui indaghiamo come è organizzata la cromatina nelle cellule sottoposte a WGD. Inoltre, studiamo quali caratteristiche della struttura della cromatina sono influenzate dal WGD e se i cambiamenti nell'organizzazione della cromatina emergono e influenzano i fenotipi cellulari dopo il WGD. Infine, esaminiamo se questi cambiamenti sono correlati ad alterazioni genetiche ed epigenetiche nei tumori guidati dal WGD.

Per comprendere l'impatto del WGD sull'organizzazione della cromatina e sullo sviluppo del tumore, abbiamo utilizzato tre distinti modelli cellulari: (1) la linea cellulare diploide non trasformata hTERT-RPE1 (di seguito denominata RPE); (2) cellule CP-A derivate da un paziente con esofago di Barrett, una condizione precancerosa che predispone allo sviluppo di adenocarcinoma esofageo attraverso WGD9,26; e (3) la linea cellulare leucemica vicino triploide K562. Per imitare il background genetico permissivo osservato nei tumori umani3,26, abbiamo utilizzato cellule CP-A carenti di p53 (Extended Data Fig. 1a) e cellule RPE (precedentemente chiamate cellule RPETP53−/−)27. Le cellule K562 ospitano già una mutazione con perdita di funzione nel gene TP5328. Le cellule WGD sono state ottenute attraverso lo slittamento mitotico in due cloni CP-A TP53−/− indipendenti (clone 3 e clone 19) e cellule K562 e attraverso il fallimento della citocinesi utilizzando due protocolli distinti nelle cellule RPE TP53−/− (Fig. 1a). Per controllare i cambiamenti di conformazione della cromatina associati all'instabilità cromosomica (CIN) ma non al WGD, abbiamo indotto CIN nelle cellule RPE TP53−/− utilizzando un inibitore MPS1 (Fig. 1a). Le analisi del ciclo cellulare e del cariotipo hanno confermato che il numero di cromosomi è raddoppiato dopo il trattamento nella maggior parte delle cellule (Fig. 1b, c e Dati estesi Fig. 1b-g) e che la dimensione nucleare è aumentata (Dati estesi Fig. 1h).

1, adjusted P < 0.01) were enriched in the interferon signalling pathway (Extended Data Fig. 4b), which is consistent with responses to abnormal mitotic segregation and stress31. Conversely, significantly downregulated genes (n = 619, log2(FC) < −1, adjusted P < 0.01) were enriched in the DNA replication, DNA repair and cell cycle pathways (Extended Data Fig. 4c), which is consistent with downregulation of DNA replication proteins in WGD cells7. Changes in expression were not associated with changes in compartment segregation and only moderately with boundary loss of insulation (Extended Data Fig. 4d,e), which indicated that these changes mostly reflected an acute cell response to WGD. In summary, WGD cells, but not CIN-only cells, exhibit LCS manifested in an increased proportion of contacts between long and short chromosomes, distinct chromatin subcompartments, and TADs./p> 0.4), which is a known oncogenic variant37. Nevertheless, this mutation was already present in RPE TP53−/− cells before WGD, and it was not sufficient to induce tumorigenesis in mice (Fig. 4c). Conversely, mutations that were acquired post-WGD did not include known oncogenic variants (Supplementary Table 3)./p> 0.3). These changes comprised upregulation of inducers of cell proliferation and migration such as CDC42, NRAS and JUN (chromosome 1p)42,43, and downregulation of CENPF (chromosome 1q), which is associated with mitotic errors44. NRAS copy number gain was accompanied by an increase in Q61R variant allele frequency (VAFtumour1 = 0.9, VAFtumour2 = 0.75, VAFtumour3 = 0.74), which suggested that the mutated allele was in the amplified haplotype. JUN overexpression was concomitant with an upregulation of components of the AP-1 transcription factor complex (JUND, JUNB, FOS and FOSB) and its downstream targets (Extended Data Fig. 8h). In summary, tumours originated from RPE TP53−/− cells that underwent WGD exhibited hallmarks of WGD-driven human tumours, such as increased CIN and complex rearrangements potentially associated with oncogene activation./p>

4N peak) were bulk sorted. Cells were allowed to recover overnight and then fixed for downstream analyses./p>

90%). Only Hi-C interactions for which anchors mapped strictly to one of the two haplotypes were retained for analysis, thus obtaining three sets of interaction types: Hap1–Hap1, Hap1–Hap2 and Hap2–Hap2./p>

2 for diploid loci) would indicate a nuclei aggregate rather than a single nucleus. Following dispensing, the single nuclei were de-crosslinked by incubation at 65 °C overnight. Next each selected nucleus was mixed with 25 µl Dynabeads MyOne Streptavidin C1 and transferred to a 1.5 ml tube and incubated at room temperature for 1 h on a rotating wheel. The bead-bound fragments were digested with 10 U of AluI restriction enzyme (New England Biolabs, R0137) in 1× rCutSmart buffer (New England Biolabs, B6004) at 37 °C for 2 h. A-tailing reaction and adapter ligation were performed for each single cell as for the bulk Hi-C processing. Similarly, PCR amplification of the single cell libraries was performed in the same master mix as described above for bulk Hi-C, for 27–30 cycles. Libraries were cleaned using AMPure XP beads and then ran on a 2% agarose gel at 100 V for 50–60 min. Successful libraries presented a 300–700 bp smear, which was cut from the gel. DNA purification from the agarose was performed using NucleoSpin Gel and PCR clean-up (Macherey-Nagel, 740609) following the manufacturer’s instructions. An additional AMPure XP bead size selection was generally necessary to remove any primer dimer contamination. Libraries were sequenced on a NextSeq550 platform (Illumina) in a PE75 configuration./p>

= 6, it was kept./p>

4N) (b) and c, Quantification of chromosomes per cell via karyotyping. Data are mean ± s.d.; Number of independent experiments is indicated. Violin plots: dashed line is median d, Examples of chromosomal instability markers (telomere fusion and chromosome breakages) in CP-ATP53−/− clone 19 cells 24 h post-WGD. n = 3 out of 30 total karyotypes presented such markers. Red arrows indicate affected chromosomes. e, Examples of bipolar and multipolar division in RPETP53−/− cells (Control and 24 h post-WGD). n = 5 dividing cells were detected for each phenotype out of ~100 total cells. Nuclei are stained in blue (DAPI), cytoskeleton (alpha-tubulin) in red, and centrosomes (pericentrin) in green./p>